Phương pháp Kỹ thuật Xét nghiệm Glucose bạn đã biết?

Sau đây tôi xin giới thiệu với các bạn phương pháp kỹ thuật xét nghiệm Glucose( Huyết thanh – Huyết tương  ).Glucose có nguồn gốc từ thức ăn hoặc được tân tạo từ các acid amin và các sản phẩm thoái hóa của Lipid do gan đảm nhiệm tổng hợp.Mục đích của việc xét nghiệm Glucose giúp ta chẩn đoán và theo dõi bệnh tiểu đường .

I.Phương pháp xét nghiệm O.ToLuidin(đây là phương pháp cũ , hiện nay không còn sử dụng nữa )

1.Nguyên tắc :

Trong môi trường acid đun nóng với sự hiện diện của Thiourea , Glucose trong huyết thanh sẽ kết hợp với O.Toluidin cho ra một phức chất màu xanh lục tỉ lệ thuận với nồng độ Glucose trong huyết thanh . Màu này được đo trong quang phổ kế.

2.Mẫu thử :

2.1 Lấy máu vào buổi sáng lúc bệnh nhân chưa ăn ( đường huyết lúc đói ).

2.2 Có thể lấy với chất chống đông K.Oxalate hoặc NaF.

2.3 Tránh đừng để mẫu thử bị tiêu huyết và nên làm sớm .( mẫu máu bị tiêu huyết sẽ làm tăng Glucose  và nếu mẫu thử để lâu sẽ làm giảm Glucose ).

3.Thuốc thử :

3.1 Acid Trichloracetic 30%. ( T.C.A 30% )

3.2 Ortho Toluidin

– Ortho Toluidin ………………………………… 60 ml.

– Thiourea…………………………………………1,5 g.

– Acid Acetic glacial………………………………940 ml.

Đựng trong chai nâu – bền 6 tháng .

3.3 Glucose chuẩn dự trữ 1 g%

– Glucose ……………………………………………1 g.

– Acid Benzoic 1%……………………………………………..100 ml.

Bền 3 đến 6 tháng ở 40C.

3.4 Glucose trực dụng 100mg%

– Glucose dự trữ 1%………………………………………….10 ml.

– Acid Benzoic 1%……………………………………………100 ml.

Giữ ở 40C

4.Kỹ thuật :

4.1 Khử bã và pha loãng dung dịch chuẩn

	U ( Mẫu Thử )	S ( Mẫu chuẩn )	B ( Mẫu trắng – ED )
Huyết thanh	0,1 ml
Glucose chuẩn 100 mg%		0,1 ml
ED ( nước cất )	0,8 ml	0,8 ml	0,9 ml
T.C.A 30%	0,1 ml	0,1 ml	0,1 ml

Trộn đều – Quay ly tâm 3000 vòng / 1 phút , trong 5 phút. Ta có 1 P.F.F.

4.2 Phản ứng màu

	U ( Mẫu Thử )	S ( Mẫu chuẩn )	B ( Mẫu trắng )
Dung dịch sau khi quay Ly tâm ( P.F.F )	0,3 ml
Dung dịch chuẩn vừa pha loãng  (Glucose chuẩn 100 mg%)		0,3 ml
Dung dịch ống B vừa pha ( dd trong ống B ở bảng trên )			0,3 ml
Ortho Toluidin	2,7  ml	2,7  ml	2,7 ml

Trộn đều – Đậy nắp và đem đun sôi ở BM ( máy đun cách thủy ) 1000C trong 8 phút – lấy ra làm nguội – Đo trên máy với bước sóng 630 nm . kết quả hiển thị trên màn hình . Hoặc

Cách tính kết quả :

ODU/ODS x 100 =                mg/dl

5.Nguyên nhân sai lầm :

5.1 Mẫu thử tiêu huyết ( làm tăng Glucose ) ,hoặc để quá lâu ( làm giảm Glucose ).

5.2 Dụng cụ dơ .

5.3 Thuốc thử mất hiệu lực .

5.4 Mực nước trong nồi đun thấp hơn mực dung dịch trong ống .

 (Phương pháp này hiện nay không còn dùng nữa vì phức tạp và có sai số cao.)

……………………………………………………………………………………………………………………

II.Phương pháp xét nghiệm Enzymatic ( Đây là phương pháp mới , sử dụng phổ biến hiện nay )

1.Nguyên tắc :

Glucose trong huyết thanh bị oxyt hóa bởi phân hóa tố Glucose Oxydase cho ra Gluconic Acid và H­2­O2  . H­­­2O­2 sẽ hợp với Phenol và 4-aminoantipyrine có sự hiện diện của Peroxidase sẽ cho ra một màu đỏ tím .

Phản ứng được tóm tắt như sau :

Glucose + O2 + H2O ( có sự hiện diện của Glucose oxidase ) cho ra Gluconic acid + H2O2         (1)

H2O2 + Phenol + 4-aminoantipyrine(có sự hiện diện của Peroxidase) cho ra Red quinone + 4H2O (2 )     

2.Mẫu thử :

2.1 Huyết thanh không tiêu huyết – Mới lấy .

2.2 Có thể dùng Huyết tương ( lấy với kháng đông Heparin Fluoride ).

2.3 Dịch não tủy .

3.Thuốc thử : Dạng KIT có sẵn . Bao gồm :

3.1 Reagent 1 ( R1 )

– Phosphate Buffer PH 7,4

– Phenol

3.2 Reagent 2 ( R2 )

– Glucose Oxidase

– Peroxidase

– 4-aminoantipyrin

3.3 Glucose standard

Loại 100mg% ( 100mg/dl = 5.55 mmol/L )

4.Kỹ thuật :

	S ( Mẫu Chuẩn )	U ( Mẫu thử )
Working Reagent ( R1 pha trong R2 )	1000 µl	1000 µl
Glucose standard	10 µl
Huyết thanh		10 µl

Trộn đều – Đọc kết quả ở máy quang phổ kế sau 30 phút ( nếu để ở nhiệt độ 200C – 250C ) và sau 10 phút ( nếu để ở 370C ) – Dùng B ( mẫu trắng là nước cất –ED ) để chỉnh máy .Màu bền trong vòng 60 phút . Đo ở bước sóng 490 – 505 nm ).Máy sẽ tính và hiển thị kết quả trên màn hình. Hoặc

Nếu đo Abs thì công thức tính là :

Au/As    x   n    =    mg/dl ( hoặc g/L , hoặc mmol/L. )

*Ghi chú :

– Nếu tính ra  mg/dl                  thì n sẽ là 100 .

– Nếu tính ra g/L                  thì n sẽ là 1 .

– Nếu tính ra mmol/L            thì n sẽ là 5.55 .

Biện luận kết quả xét nghiệm:

1.Trị số bình thường :

– Phương pháp O.Toluidin :    70 – 110 mg% ( mg/dl )

– Phương pháp Enzymatic  :    75 – 115 mg% ( mg/dl )

                                         Hay 4,2 – 6,4 mmol/L

2.Trị số gia tăng :

Trong một số bệnh lý sau đây :

–         Tiểu đường

–         Cường tuyến giáp

–         U tủy thượng thận

3.Trị số giảm :

Trong một số bệnh lý sau đây :

–         Xơ gan , thiểu năng gan .

–         Cường tuyến tụy

• Khả năng ngưỡng thận của Glucose máu là 170 – 180 mg/dl.
• Nếu lượng Glucose máu > 400 mg/dl , phải pha loãng huyết thanh và làm lại sau đó lấy kết quả nhân với hệ số pha loãng.

Trên đây là 2 phương pháp định lượng Glucose huyết thanh.

Tuy nhiên hiện nay các phòng xét nghiệm đều làm trên máy bán tự động hoặc tự động nên cách tính kết quả do máy tự làm chúng ta chỉ thực hiện thao tác kỹ thuật bên ngoài , nhiều phòng xét nghiệm có thể dùng nhiều bộ KIT thử do các hãng sản xuất cung cấp khác nhau và có thể thay đổi chút ít về Kỹ thuật nhưng vẫn đãm bảo kết quả không thay đổi nhiều.Ngày nay các bệnh viện đều sử dụng đơn vị là mmol/L ( Đơn vị Quốc tế ).